كيت سنجش پروتئين به روش برادفورد

مقدمه: 

سنجش پروتئین به روش برادفورد یک روش رنگ سنجی سریع، ساده، دقیق و حساس است که براي اندازه گیري غلظت پروتئین در انواع محلولها به کار میرود. در این روش از برهم کنش پروتئین ها با رنگ آبی کوماسی 250-G کمپلکس آبی رنگ ایجاد میشود. زمانی که رنگ کوماسی در محیط اسیدي به پروتئین متصل شود، رنگ از قهوه اي معرف به آبی تبدیل شده و در نتیجه جذب نوري تغییر میکند، که در طول موج 595 نانومتر داراي بالاترین میزان جذب میباشد. کیت سنجش کمی پروتئین، محصول شرکت پادتن زیست فراورده پردیس پاسارگاد میباشد که مقرون به صرفه، تکرارپذیر، استاندارد و سازگار با طیف وسیعی از مواد محلول بوده و براي پروتئین هاي گوناگون در نمونه هاي بیولوژیکی و غیر بیولوژیک مناسب است. سنجش پروتئین با روش رنگ سنجی و در طول موج 595 نانومتر انجام می پذیرد و به صورت غلظت پروتئین (µg/ml) گزارش میگردد. به منظور تعیین غلظت پروتئین در نمونه مجهول از یک پروتئین استاندارد (آلبومین سرم گاوي) استفاده می شود.

روش:

فتومتریک بر اساس روش Bradford

اساس آزمایش:

در این روش از برهم کنش پروتئین ها با رنگ آبی کوماسی 250-G کمپلکس آبی رنگ ایجاد میشود.

محتویات و مقادیر کیت:


شرایط نگهداری محلولها:

محلولها باید در دماي 2 تا 8 درجه سانتیگراد نگهداري شوند و تا تاریخ مندرج بر روي ویالها قابل مصرف میباشد. توجه: از قرار دادن محلولها در مجاورت نور خودداري شود.

معرف برادفورد آماده استفاده است. محلول استاندارد را درون میکروتیوب تقسیم و در دماي 20 - درجه سانتیگراد نگهداري کنید. رقت هاي محلول استاندارد در موقع انجام آزمایش ساخته شود.

لوازم و مواد مورد نیاز: 

تجهیزات معمول آزمایشگاه پزشکی (ست سمپلر متغیر و سر سمپلر، میکروتیوب، لوله شیشه اي، آب دیونیزه و دستگاه اسپکتوفتومتر)

روش انجام آزمایش:

  1. طول موج: 595 نانومتر ، قطر کووت: یک سانتیمتر، دما: درجه حرارت اتاق، اندازه گیري: اسپکتوفتومتر با بالنک (که حاوي معرف و آب دیونیزه) روي صفر تنظیم شود.
  2. جهت تهیه رقتهاي استاندارد، 6 میکروتیوب بردارید.
  3. جز میکروتیوب اول به سایر آنها 50 میکرولیتر آب دیونیزه بیفزاید. به میکروتیوب اول فقط 100 میکرولیتر محلول استاندارد افزوده و 50 میکرولیتر آن را به میکروتیوب بعدي منتقل نموده و سري رقت تهیه کنید.
  4. بر اساس نیاز می توانید از نمونه هاي مجهول نیز سري رقت تهیه نمایید.
  5. در مرحله بعد، 7 لوله شیشه تمیز جهت شش استاندارد و یک بالنک و به تعداد مورد نیاز لوله براي نمونه مجهول برداشته و شماره گذاري کنید.
  6. به هر کدام از لوله ها به میزان 2 میلیلیتر از محلول برادفورد بیفزاید. به طور کلی به ازاي 1 بخش از نمونه 50 بخش معرف برادفورد استفاده میشود.
  7. از محلولهاي استاندارد و نمونه مجهول به میزان 40 میکرولیتر در هر لوله اضافه نمایید.
  8. در لوله بالنک 40 میکرولیتر آب دیونیزه اضافه نمایید.
  9. لوله ها را به مدت 5 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید. این کمپلکس کمتر از یک ساعت پایدار است.
  10. با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر و با طول موج 595 نانومتر، نمونه ها را بخوانید.

 

عوامل مداخله گر:

برخی از دترجنت ها مانند Triton-X100 ، NP-4 و  SDS

حساسیت: 

2000 تا 62/5 میکروگرم در میلیلیتر

محاسبات:

جذب بدست آمده و غلظت هاي استانداردها و نمونه ها را در نرم افزار اکسل وارد نمایید. سپس نمودار پراکندگی آن را رسم کنید.

فرمول خط حاصل از غلظت هاي مختلف استاندارد: y=Ax+B Y

Y =جذب نوري استاندارد، A = شیب خط، X = غلظت استاندارد ها بر حسب میکروگرم در میلی لیتر، B = عرض از مبدا.

با توجه به فرمول خط حاصل از نمودار روش استاندارد، میزان پروتئین در نمونه هاي مجهول را می توان نیز از فرمول زیر محاسبه نمود: (K= ضریب رقت)



منابع:

Bradford MM, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, 72, 248–254 (1976). (1976

لطفا در صورت نیاز به اطالعات بیشتر با شماره تلفن هاي و یا 09131397977و 09136487821 تماس حاصل فرمایید.